De gedwongen hereniging van de beide landen werd door België van het begin af aan tegengewerkt. In 1830 braken de eerste relletjes uit in Brussel die uitmondden in een opstand. Willem I stuurde zijn zoon prins Frederik met een leger naar Brussel, waar straatgevechten uitbraken. Hij moest zich na drie dagen terugtrekken. Kort daarop werd de Belgische onafhankelijkheid uitgeroepen. Aanvankelijk wilde men via een bestuurlijke scheiding of een grondwetswijziging de geschillen oplossen. Willem I verwierp echter alle scheidingsvoorwaarden en trok in 1831 met een leger op naar Brussel. In deze ‘Tiendaagse Veldtocht’ werd het Belgische leger verslagen, maar Willem I moest zich terugtrekken voor het te hulp geschoten Franse leger. Engeland en Frankrijk schaarden zich achter de Belgen en sommeerden Willem I zijn aspiraties op te geven. De koning weigerde, waarop Engeland en Frankrijk Nederlandse schepen een embargo oplegden en de havens blokkeerden.

Op 4 juni 1831 werd Leopold van Saksen-Coburg gekozen tot koning der Belgen. In 1831 werd de ‘Londense Conferentie’ gehouden tussen Engeland, Frankrijk en Nederland, waar in 24 artikelen de afscheiding van België werd geregeld. Het embargo werd opgeheven, maar beide landen hielden hun legers op oorlogssterkte. Pas in 1838 accepteerde Willem I de afscheiding en volgde in 1839 het Eindverdrag met België.

De nieuwe staat in wording had gedurende de Brabantse Omwenteling in 1789 al even mogen proeven aan de onafhankelijkheid. De krachten die naar de Belgische onafhankelijkheid streefden waren dan ook gedurende de negen jaar van de samenvoeging met de noordelijke Nederlanden steeds werkzaam gebleven.
Willem I was zeer teleurgesteld over de afscheiding. Toen tenslotte zijn voorgenomen huwelijk met de katholieke Belgische gravin Henriëtte d’Oultremont de Wégimont, zijn tweede huwelijk, op hevig verzet en kritiek stuitte, was dat voor hem aanleiding om in 1840 afstand te doen van zijn troon. Hij overleed op 12 december 1843.