In 1492 hadden de gewesten Vlaanderen, Artois, Brabant, Limburg, Namen, Luxemburg, Henegouwen, Holland en Zeeland, Filips de Schone als hun landsheer erkend. Gelre en Zutphen kregen hun eigen landsheer in de persoon van Karel van Egmond. De gewesten Luik, Utrecht, Friesland en Groningen bleven zelfstandig. Karel van Egmond en Filips de Schone hadden elkaar fanatiek bestreden om de heerschappij over de nog vrije gewesten. Karel V, zoon van Filips de Schone, die in 1515 meerderjarig werd, wist al deze gebieden, met uitzondering van Luik, aan zich te binden. Zo ontstond er in de zestiende eeuw een zekere samenhang tussen de Nederlanden.

In 1517 vertrok Karel V naar Spanje om zijn grootvader Ferdinand op te volgen. Karel V bleef voor de rest van zijn regeerperiode in Spanje wonen, om slechts voor korte of langere tijd in de Nederlanden te verblijven. Opnieuw werd Margaretha van Savoye landvoogdes over de Nederlanden.
In 1519 volgde Karel V ook zijn grootvader Maximiliaan op en werd hij tevens keizer van Duitsland. Hij regeerde nu over een immens rijk, waar ook de gebieden in de Nieuwe Wereld toe behoorden, die door de Spanjaarden waren veroverd.

Karel V voerde een sterke centralisatiepolitiek. Hij legde het ‘ Groot-Privilege’ naast zich neer, dat door zijn grootmoeder was ingesteld en dat de gewesten meer politieke vrijheid gaf. In 1531 werd door Karel V het centrale bestuur hervormd. Tevens werd zijn zuster Maria van Hongarije na de dood van Margaretha van Savoye landvoogdes over de Nederlanden. De Grote Raad werd gescheiden in drie afzonderlijke raden: De Raad van Financiën, de Geheime Raad en de Raad van State. Van deze laatste maakten ambtenaren en hoge edelen deel uit. De taak van de Raad van State was de landvoogdes over alles te adviseren. Ook stelde Karel V in de gewesten stadhouders aan, die in zijn naam regeerden. Maria vergaderde bijna dagelijks met enkele vertrouwelingen, waar de hogere adel doorgaans niet voor werd uitgenodigd. Dit riep veel weerstand op.

Onder de regeerperiode van Karel V ontstonden ook godsdienstige vernieuwingen. In 1517 spijkerde de Duitse augustijner monnik Maarten Luther zijn 95 stellingen aan de kerkdeur van Wittenberg, waarmee hij uiting gaf aan de onvrede die er heerste over het functioneren van de Katholieke Kerk. Zijn protest was vooral gericht tegen de winstgevende aflaathandel, waarmee men kwijtschelding van straf voor bedreven zonden kon afkopen. Karel V bestreed de reformisten te vuur en te zwaard. De aanhangers wachtte doorgaans de brandstapel. Vooral in de Nederlanden vielen de denkbeelden van Luther in vruchtbare bodem.
Omdat eenderde van de bevolking kon lezen en schrijven, werden de hervormingen in de Nederlanden gedragen door een groot deel van de volk. Er ontstonden diverse stromingen. De radicale leer van de Fransman Johannes Calvijn (1509-1564) won snel aan invloed. De eredienst van de Calvinisten was uiterst sober. De beelden die de rooms-katholieke kerken sierden werden gezien als afgodsbeelden.
Een andere belangrijke Europese stroming uit die tijd was het Humanisme. De beroemdste vertegenwoordiger hiervan was de in Rotterdam geboren Desiderius Erasmus (1469-1536). Eén van zijn bekendste werken is ‘De Lof der Zotheid’; een satire op de misstanden in de kerk en samenleving. Hij probeerde humanisme, waarbij grote waarde wordt gehecht aan de vrije en zelfstandige persoonlijkheid, te verenigen met het christendom.

In 1555 ondertekende Karel V de vrede van Augsburg, samen met de lutherse vorsten van het Duitse Rijk en de rooms-katholieken. Daarbij werd vastgesteld dat de landsheer mocht bepalen welke godsdienst in zijn gebied mocht worden uitgeoefend. Voor de Nederlanden betekende dit dat het katholiek moest blijven. Karel V nam in dat jaar uiterst teleurgesteld afstand van zijn troon, omdat hij er niet in was geslaagd de eenheid van het christendom in zijn rijk te behouden. Hij werd door zijn broer Ferdinand opgevolgd als keizer van het Duitse Rijk. Zijn enige zoon Filips II werd koning van Spanje en van de zeventien Nederlandse gewesten.